氮源對C. vulgaris 油脂積累的影響研究論文

小球藻是一種普生性單細胞綠藻，在自然界分佈廣泛，營養需求簡單，可利用光照進行自養生長，也可利用有機物進行異養生長。藻細胞內含有豐富的氨基酸、藻蛋白、生物多糖和多種維生素、不飽和脂肪酸及礦物質，具有降血脂、降血壓，增強免疫力，抗腫瘤等多種保健功能。由於其生長速率，光合效率，比表面積和積累油脂含量高於其他油料作物，而被廣泛用於研究微藻油脂的積累。碳、氮、磷和某些金屬離子對小球藻的生長和油脂的積累有重要的作用，其中研究較多是氮源因素。氮源是藻類生長髮育所必須的重要營養元素，不同的藻種對氮源的要求有差異，氮源的種類和濃度發生變化，會影響微藻，如微藻的生長，油脂含量，脂肪酸成分等生理生化特徵的改變。王順昌等認為尿素有利於蛋白核小球藻的生長及其色素積累，而硝態氮則利於其中性脂肪酸積累。朱義平等發現低濃度NaNO3可使小球藻油脂含量增多; 丙氨酸可促使生物量增多，但油脂含量有所下降; 酪氨酸可降低細胞生物量，但油脂含量較高。Cha等證實在低氮條件下，小球藻產生的油脂含量有所增多。通過研究發酵過程中不同氮源對小球藻細胞生長和油脂積累的影響，確定了小球藻的最適培養條件; 並以此為基礎，研究了含氮培養和缺氮培養下，小球藻氮消耗、生物量、油脂含量、生物量對氮得率和相對油脂對氮得率的變化，以探索通過改變氮源，調控小球藻細胞內組分的手段。

1 材料與方法

1. 1 菌種與培養基

小球藻Chlorella vulgaris C95，購自中國海洋大學。BG11 培養基[13] ( g /L) ，NaNO3 1. 50、K2HPO40. 04、MgSO4·7H2O 0. 075、CaCl2·2H2O 0. 036、Citric acid 0. 006、Ferric ammonium citrate 0. 006、EDTANa20. 001; Na2CO3 0. 02、微量元素混合液A5( mg /L) : H3BO3 2. 86、MnCl2·4H2O 1. 86、ZnSO4·7H2O 0. 22、Na2MoO4·2H2O 0. 39、CuSO4·5H2O0. 08、Co( NO3)2·6H2O 0. 058; 無氮BG11 培養基( BG11-N) ( g /L) : 以等濃度的NaCl 替代BG11 中的NaNO3，其他成分等同BG11。

1. 2 實驗方法

1. 2. 1 種子培養

挑取固體平板上培養的藻株至含有1 mL BG11培養基的試管中，混勻。取適量接種於含有10 mL培養基的100 mL 三角瓶中，置於恆温光照搖瓶櫃中培養，培養條件為: pH 7. 5，温度28 ± 0. 2 ℃，光照強度4 000 lx，以16 h ∶ 8 h 的光周期給予光照，以110r /min振盪培養。

1. 2. 2 氮源優化的培養

1. 2. 2. 1 添加不同氮源種類的藻細胞培養

將培養至對數生長期的藻細胞懸浮液，接種於含200 ml 已滅菌的無氮BG11 培養基( 氮源濃度為0 mg /L) 的500 mL 三角瓶中。分別添加NaNO3、NH4Cl 和CO( NH2)2作為氮源，調整其濃度等同於，採用BG11 培養基培養的氮源濃度( 1. 50 g /L) 。調整初始pH 為7. 5，初始接種濃度為吸光值0. 35 ±0. 05( OD680 nm) ，於温度( 28 ± 0. 2 ) ℃，光照強度4 000 lx，16 h∶ 8 h 的光周期下，培養8 d。

1. 2. 2. 2 不同氮源底物濃度下藻細胞的培養

將培養至對數生長期的藻細胞懸浮液，接種於含200 ml 已滅菌的無氮BG11 培養基的500 mL 三角瓶中。以C. vulgaris C95 最適氮源種類為氮源，調整氮源濃度，分別為0. 4 g /L、0. 8 g /L、1. 2 g /L 和1. 6 g /L，其他培養條件同方法1. 2. 2. 1。

1. 2. 3 含氮培養

收集培養至對數生長期的藻細胞，接種於含有200 mL 優化的BG11 培養基的500 mL 三角瓶中。調整初始pH 為7. 5，初始接種濃度為吸光值0. 35± 0. 05 ( OD680 nm) ，於温度( 28 ± 0. 2) ℃，光照強度4 000 lx，16 h ∶ 8 h 的光周期下，培養6 d。

1. 2. 4 缺氮培養

收集培養至對數生長期的藻細胞，接種於含有200 mL 的優化BG11-N 培養基的500 mL 三角瓶中。其他條件同1. 2. 3。

1. 2. 5 生物量的檢測

根據黃美玲等的方法建立藻體乾重與OD680 nm的關係曲線，公式為y = 358. 70x - 11. 691，R2 = 0. 9983( y 為藻體乾重，mg /L，x 為藻體的光密度( OD680 nm) ) 。培養期間每24 h 取樣，採用分光光度計檢測680 nm 下藻體的光密度( OD680 nm) 。

2 結果與討論

2. 1 不同氮源對小球藻生長及油脂含量的影響

2. 1. 1 不同氮源底物對C. vulgaris C95 生長影響的比較

以BG11 培養基為基礎，選擇NaNO3、NH4Cl 和CO( NH2)2作為氮源底物，培養C. vulgaris C95，連續培養8 d。考察3 種氮源底物對C. vulgaris C95 細胞生長和油脂含量的影響。3種氮源底物下，C. vulgaris C95均能正常生長並獲得較高生物量。在( 0 ～ 7) d 內，C. vulgaris C95 的生物量隨着培養時間的延長而增多，第7 d 時達到最大。隨後，生物量下降。其中，以NaNO3為氮源底物的效果最好，最終生物量為488. 9 mg /L，氮源效果依次為CO( NH2)2和NH4Cl。3種氮源底物下，C. vulgaris C95 積累的油脂各不相同。其中，氮源底物為NaNO3時，油脂積累均高於其他氮源，油脂含量為9. 79%，氮源效果依次為NH4Cl 和CO( NH2)2。研究發現，培養小球藻時，銨離子代謝會影響藻細胞懸浮液的pH變化，偏離最適pH，使藻細胞的光合作用受阻和碳氮代謝失調，導致藻細胞的生長受到抑制。以CO( NH2)2為氮源底物時，高濃度CO( NH2)2的對小球藻的生長有抑制，導致小球藻在1. 5 g /L 的氮源中生物量較低。綜合比較C. vulgaris C95 生長和油脂積累情況，選擇NaNO3作為培養小球藻的氮源底物。

2. 1. 2 氮源底物濃度對C. vulgaris C95 油脂積累的影響

以NaNO3為氮源底物，氮含量分別為0. 4 g /L、0. 8 g /L、1. 2 g /L 和1. 6 g /L，培養C. vulgaris C95。考察了C. vulgaris C95 在不同NaNO3濃度下細胞生長和油脂積累的情況，培養8 d 時，1. 6 g /L NaNO3為氮源培養小球藻的生長情況最佳，其生物量高達為562. 2 mg /L。其他氮源培養小球藻效果高低依次為1. 2 g /L、0. 8 g /L 和0. 4 g /L。以油脂含量為考察主體時，0. 8 g /L NaNO3為氮源培養小球藻，獲得油脂含量最多為12. 01%; 1. 2 g /L NaNO3為氮源培養的次之，為9. 79%; 0. 4 g /L 和1. 6 g /L NaNO3為氮源培養的小球藻獲得油脂含量分別為9. 06% 和9. 64%。但培養至第6 d 時，0. 4 g /L NaNO3培養小球藻，獲得油脂含量高於其他氮源。可見，在不同培養時間下，不同濃度的氮源，對小球藻油脂含量的積累有所不同。為獲得較高油脂含量的小球藻，採用0. 8 g /L NaNO3作為培養小球藻的氮源底物。

2. 2 含氮培養下小球藻對氮的利用效果

以0. 8 g /L NaNO3培養小球藻C95，考察了氮消耗、生物量和油脂含量的變化，及生物量氮消耗比率和油脂氮消耗比率，隨着生長的進行，小球藻對氮的消耗在不斷增加，隨後趨向平穩; 小球藻的生物量和相對油脂含量逐漸增大，至第6 d 達到最高，分別為626. 3 mg /L和11. 68%。隨後生物量和相對油脂含量迅速下降。在氮的消耗迅速下降時，小球藻的生物量卻逐漸增多，其原因可能為小球藻吸收的氮元素，需經過一定的蛋白轉化為谷氨醯胺或穀氨酸等，才能被小球藻的生長所利用的有機物質。另外，由於蛋白的合成和氮元素的轉化需要一定的時間，導致氮的'消耗與生物量的積累呈現的趨勢不相同。小球藻的生物量氮消耗率和油脂氮消耗比率逐漸增大，至第6 d 達到最大，分別為0. 45 和0. 07。兩者呈現相同的趨勢，原因為小球藻的生物量和油脂積累同時增加和減少。

2. 3 缺氮培養對小球藻的生長和油脂含量的影響

以缺氮培養小球藻C95，其生物量、油脂含量和氮消耗。小球藻的生物量第2d 時，達到最大生物含量332. 8 mg /L，隨後逐漸減少; 小球藻的油脂含量逐漸增大，第5 d 時達到最大，為13. 49%; 小球藻對氮的消耗在不斷增加，隨後趨向平穩。本研究發現藻在低氮濃度培養油脂含量高，此結果與當前報道大多數結果基本一致。同時缺氮培養時，達到最大油脂含量時只需5 d，比文獻報道結果相比，約節省50%的培養時間，這為培養小球藻生產生物柴油提供了重要的理論依據。生物量氮消耗率，在第2 d 時，達到最大為4. 72; 油脂氮消耗比率在第5 d 時，達到最大為0. 85。生物量氮消耗比率和油脂氮消耗比率的趨勢主要取決於生物量和相對油脂含量的走勢。

含氮培養時可獲得較高的生物量，其生物量約為缺氮培養的1. 9 倍; 獲得較高油脂含量需採用缺氮培養小球藻，其油脂含量比含氮培養的高約15%。根據圖4 和圖6 可知，缺氮培養獲得生物量氮消耗比率和油脂氮消耗比率要高於含氮培養，其原因為缺氮培養的藻液中含有的氮元素較低，導致生物量和油脂氮消耗比率較高。另外，缺氮培養時，油脂含量較高，也是導致油脂氮消耗比率較高的原因。

3 結論

在正常培養中，小球藻C95 以1. 6 g /L NaNO3為氮源時，可達最高生物量562. 2 mg /L，最大油脂含量是以0. 8 g /L NaNO3為氮源。缺氮培養時，最大相對油脂含量為13. 49%，比含氮培養高約15%;含氮培養時，最高生物量為626. 3 mg /L，比缺氮培養高約1. 9 倍。

在積累油脂的藻類中，細胞內油脂積累往往與氮源脅迫有關。本研究表明，以獲取微藻生物量為目的，可通過含氮培養; 以獲取微藻油脂為目的，則可採用缺氮培養。發酵培養過程中可通過改變氮源調控微藻生理代謝流向，以達到增強細胞內主要營養成分合成的目的。